限制酶切割位点讲解（如何让你的酶切反应“时半功倍”？）
100次浏览 发布时间：2024-09-08 08:05:07
限制性核酸内切酶(以下简称限制性酶)是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。
限制性酶切看似简单，但其实暗藏玄机。如果单单按照protocol上面操作，结果往往是不理想的。那么今天小编就会给你介绍一下酶切实验操作过程中需要注意的几个方面，哪怕是小细节，也至关重要。
1、记得加牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA），达到稳定限制性酶的效果，并且减少内切酶粘附试管壁的情况。传统的方法是单独购买BSA溶液，现在越来越多的缓冲液例如Tango Buffer或是Mastermix都含有BSA，从而使酶切实验更为简便。
2、如果限制性酶的反应效率在含盐缓冲液中(e.g., NEBuffer 3.1) 很低，说明很有可能这种酶对盐量敏感。在DNA 的制备过程中，要尽量清除掉溶液中的盐分。
3、限制性酶的总体积要少于总反应液体积的10%。用于保存酶的甘油如果过多，会抑制酶切反应，大大降低酶切的效率。
4、在保证第3条的前提下，加尽可能多的限制性酶来提升反应效率。这里要强调下一单位（1U）的定义，一单位酶可以在一小时内标准反应条件下酶切1 µg的DNA。如果担心甘油会抑制酶切，可以考虑购买单位浓度比较高的限制性酶。每一个生产商都会标明浓度单位，例如10U/µL。
5、进行无酶切、单酶切测试。不管是什么实验，都要有对照实验来证明结果的有效性。不加入任何限制性酶，或是加入单一酶都可以很好的验证限制性酶的效率并且分辨出假阳性实验结果。
6、查看限制性酶的反应效率表和相对应的保护碱基。限制性酶除了识别特定的DNA序列外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的。每一个酶的工作效率和保护碱基的长短不尽相同，要根据个人使用的酶的特点来设计实验才能达到理想的效果。
-
-
如果告别不能笑着说高质量好文颜书逸宋雯沁颜以宸推荐完本_已完结如果告别不能笑着说高质量好文（颜书逸宋雯沁颜以宸）
主角是颜书逸宋雯沁颜以宸的《如果告别不能笑着说高质量好文》,是作者“颜书逸”的作品,主要讲述了: 颜书逸将房间又简单的打扫了一下，又将自己的行李箱打开，将衣服全部拿出来以后重新放到衣柜里。又将自己易碎的物品都拿出来一一摆好。看着被自己布置好的房间，颜书逸这才满意的洗漱上床。飞机上的那一觉实在睡得不.
2025-05-08 23:00:00
-
-
贺知意苏凛安续集(知意何曾知他意)全本完整免费版_起点章节+后续（贺知意苏凛安）
恍惚片刻，贺知意拿起了手机。她自己都没注意到，指尖正不受控制的轻颤。屏幕亮起，里面堆满了密密麻麻的文字。一字一句的阅读，目光定在“重度抑郁”这几个字上。脑海中轰然嗡鸣一声。“……重度抑郁？”贺知意脸色惨白，艰难的从牙缝间溢出发颤的音调。她忽然想起，苏凛安站在她面前，一遍遍诉说着爱意，渴求她拥抱的模样
2025-05-08 22:38:49
-
-
深夜街头，他的“约会专车”竟是偷来的……
【来源：连云港警方】5月3日凌晨东海一名男子竟因“没车约会”将黑手伸向4S店门口的崭新电动汽车东海警方接报后快速反应仅用3小时就破案结束了这场荒诞剧凌晨1点“见车起意”当日凌晨1时许52岁的李某骑自行车途经东海开发区某汽车4S店时发现店门口停着好几辆崭新的电动汽车更让他意外的是其中一辆车的车钥匙竟“
2025-05-08 22:09:00
-
-
欧盟拟对价值近千亿欧元美国商品征税
新华社布鲁塞尔5月7日电 欧盟官员7日表示，如与美方关税谈判破裂，欧盟计划对价值近1000亿欧元的美国商品征税，以报复美国此前实施的关税措施。法新社当天援引欧盟外交官的话报道，欧盟委员会拟反制美方关税措施，对美国商品征税。目前，欧盟面临美国对钢铁、铝和汽车征收25%的进口关税，以及对几乎所有其他商品
2025-05-08 21:21:00
-
-
巴基斯坦国防部长：没空间可缓和局势，冲突正进入盲目升级阶段！印度无人机未对拉合尔防空系统造成任何损害
巴基斯坦国防部长：印度无人机未对拉合尔的防空系统造成任何损害格隆汇5月8日｜巴基斯坦国防部长：几乎没有空间可以缓和局势，冲突正进入盲目升级的阶段。印度无人机未对巴基斯坦军事基地造成任何损害。印度无人机未对拉合尔的防空系统造成任何损害。在巴基斯坦的任何报复行动中，将针对印度的军事设施。（来自格隆汇 A
2025-05-08 21:01:00